Notre objectif est de comprendre les mécanismes qui déterminent les axes embryonnaires. Ces mécanismes sont à l'origine de la polarisation progressive de l'information maternelle pendant l'ovogénèse, la maturation et les premiers clivages. Les clefs de cette compréhension résident dans les processus de localisation et de l'activation traductionnelle des ARN essentiels pour le développement. Le projet repose sur l'expertise de 3 équipes (Sardet/Houliston/McDougall) et leur réseau de collaborations (Nishida / Standart / King / Deshler / Woodland / Osborne / Manuel). Les résultats espérés sont une compréhension de la conservation des mécanismes des évènements de polarisation chez 2 organismes chordés modèle (ascidie, Xénope) et un nouveau modèle, le cnidaire Clytia, méduse au cycle maitrisé (programme EST engagé). Le projet s'articule autour des thèmes suivant : 1) Localisation des ARNm. Les mécanismes impliqués dans la localisation des ARN messagers dans les plasmes germinaux et dans le cortex des ovocytes de Xénope et d'ascidies seront comparés a ceux mis en œuvre chez Clytia. Nous utiliserons des méthodes d'imagerie haute résolution d' ARN fluorescents in vivo et d' hybridation/immunolocalisation in situ (ARNm Vg1, Xcat2, PEM1, macho1,..). Ces ARNs et leurs proteins de liaison identifiées grace aux approaches de protéomique / génomique avec nos partenaires seront simultanément analysées à l'aide d'anticorps spécifiques et de marquages fluorescents. La manipulation des séquences d'ARN et l'étude du comportement des proteins de liaison à l'ARN permettront d'analyses les relations entre localisation et controle traductionel des ARNm. 2) Maturation meiotique et polarisation des ovocytes. Nous étudierons les liens entre les facteurs de régulation du cycle et la polarisation dans l'ovocyte d'ascidie basé sur notre observation récente que la polarité s'établit lors de la migration du fuseau meiotique vers le cortex. Chez le Xénope, nous examinerons le role des évènements de phosphorylation controlés par les kinases meiotiques dans l'ancrage des ARNm au cortex végétatif et la dérepression concomitante de leur traduction. 3) Réorganisations cytoplasmiques et corticales liées aux facteurs du cycle cellulaire. Cette question sera principalement examinée sur les œufs de la méduse Clytia en utilisant des inhibiteurs spécifiques et la microinjection localisée de régulateurs du cycle (notament Cdc2/cyclinB et ses kinases activatrices). Nous suivrons la localisation et la dynamique des régulateurs de la mitose fluorescents (constructions GFP) grace aux méthodes d'imagerie confocale rapide et déconvolutions. Nous analyserons également le role des vagues de contraction de surface (SCWs) dans l'établissement de la polarité chez les ascidies et chez Clytia. 4) Regulation de la polarité cellulaire au cours du développement précoce. Nous poursuivrons nos recherches sur le role des proteine de polarité s PAR dans les embryons d'ascidies et nous aborderons leur identification et role chez Clytia. Nous préciserons la nature des interactions entre les PAR, les structures corticales et microtubulaires pour comprendre les mécanismes présidant aux divisions inégales (stades 8-64) qui donnent naissance aux lignées germinales et musculaires du tetard d'ascidie. Outre une contribution aux couts de fonctionnement nécessaire nous demandons les financements pour 2 Post Docs qui travailleront entre les équipes et avec les collaborateurs. Au niveau des methodologies, le projet requiert un microscope confocal rapide et sensible qui complémentera notre plateforme d'imagerie et permettra d'analyser in vivo les proteines et ARNm fluorescents impliqués dans les processus de polarisation des oeufs, ovocytes et embryons.

Nous proposons de mettre en place un crible pan-génomique sans précédent, dont le but est d'identifier de nouveaux gènes impliqués dans plusieurs voies de signalisation majeures (insuline/IGF, Hedgehog, JNK, JAK/STAT), contrôlant le développement, la morphogenèse, ou la croissance tissulaire chez la drosophile. A cette fin, nous exploiterons une collection unique de lignées transgéniques exprimant des ARN double-brin sous contrôle du système inductible Gal4/UAS, permettant une extinction génique par effet RNAi ( silencing ) de façon tissu-spécifique. Ce crible RNAi pan-génomique est rendu possible grâce à une collaboration internationale exclusive impliquant nos 3 laboratoires et celui du Dr R. Ueda (National Institute of Genetics, Japon). En partenariat avec la société Mitsubishi, le Dr Ueda génère des lignées transgéniques permettant l'expression de constructions RNAi dirigées contre chacun des 14.000+ gènes du génome de la drosophile. Nos laboratoires ont ou développent actuellement des lignées GAL4 portant des marqueurs spécifiques des voies de signalisation d'intérêt. Ces lignées seront croisées aux lignées RNAi afin d'induire des invalidations spécifiques de chacun des gènes, qui seront testées pour des défauts phénotypiques ou des altérations de l'activité des voies de signalisation. La fonction de chaque nouveau gène candidat sélectionné sera étudiée selon des approches classiques mises en place de façon routinière dans les différents laboratoires du projet. Ce projet ambitieux requiert la mise en place d'une structure commune permettant la manipulation, le tri et le croisement de centaines de lignées en flux constant. Cet effort majeur ne peut être réalisé que sous la forme d'une collaboration entre équipes voisines impliquées dans des interactions régulières. Un effort commun de crible génétique a déjà porté ses fruits dans le passé et les membres de nos équipes ont l'habitude de travailler ensemble. L'expertise complémentaire des équipes constituantes sera ensuite exploitée pour l'analyse détaillée des gènes impliqués dans : le contrôle de la mise en place du patron de développement (Thérond, Noselli), la prolifération et la croissance tissulaire (Léopold, Thérond, Noselli), la morphogenèse tissulaire (Noselli, Thérond, Léopold). Ce crible RNAi pan-génomique inédit permettra de réaliser de nombreuses avancées dans les domaines de la morphogenèse et de la croissance, qui sont des sujets majeurs de la Biologie soutenus par cet appel d'offre.

The JNK (Jun N-terminal Kinase) signaling pathway is a fundamental regulator of epithelial morphogenesis and has also been involved in immunity, cell death, wound healing, regeneration and some human cancers. In Drosophila embryos, JNK controls dorsal closure, an epithelial morphogenetic movement consisting of the collective and coordinated migration of two epithelial sheets and their fusion at the dorsal midline. Activation of the JNK pathway in cells at the front of migration (leading edge) is essential in this process. We performed a genomic analysis using microarrays to identify genes that are activated by JNK during dorsal closure. Thirty-one genes were validated experimentally, while only two were known previously. Eight of these genes showed a specific JNK-dependent expression in the leading edge. Surprisingly, this expression is not uniform, but seems to follow the segmented pattern of the embryonic epidermis. At the onset of dorsal closure, the segments are fully formed due to the action of the primary segmentation genes engrailed, wingless and hedgehog. Once established, the segmental compartments are fixed and do not show plasticity. We recently characterized a unique case of breaking of the segment boundary during dorsal closure. Specific cells (called Mixer cells) cross the border and enter the adjacent posterior compartment, releasing tissue tension as dorsal closure proceeds. This cell mixing behavior is mediated by a JNK-induced developmental reprogramming involving de novo expression of engrailed. The research project is divided in three tasks. We first want to characterize the function of the 31 new JNK target genes during dorsal closure using classical genetics and UAS-GAL4-induced RNAi in fly embryos. Molecular tools (specific antibodies, expression vectors …) and genetic tools (mutants, recombinants …) will be developed for these essential genes and dorsal closure defects will be linked to cellular modifications (cytoskeleton, adhesion, polarity …) of the leading edge cells to understand their function. Second, we would like to analyze the influence of the segmentation genes on the JNK transcriptional response at the leading edge. We will develop a quantitative analysis of the expression at the leading edge based on fluorescent in situ hybridization. This will allow us to determine the segmental profile for each gene, and then to test which of the segmentation genes contributes to the non-uniform expression along the segment. The third task of the project aims to understand how the JNK pathway controls cell reprogramming/mixing and to find the function of this unique event taking place during dorsal closure. We will carry out a targeted RNAi screen (chromatin, kinases, phosphatases) in the embryo to identify the molecular and cellular mechanisms that are involved. In addition, we would like to directly answer the question of how the Mixer cell is reprogrammed, i.e. how the JNK pathway regulates the expression of engrailed. Previous studies in Drosophila have shown that the chromatin, and in particular the repressor proteins of the Polycomb family, regulates the expression of engrailed, and that the JNK activity is able to relieve the negative action of these proteins during the regeneration process. Therefore we will test the effect of JNK on the Polycomb proteins in the Mixer cells for the expression of engrailed. Overall, this study intends to better understand the role of the JNK pathway in epithelial morphogenesis and developmental reprogramming, as well as the interaction between dorsal closure (i.e. morphogenesis) and the segmentation (i.e. patterning) of the embryo. As JNK is involved in oncogenesis in vertebrates, as well as in wound healing and regeneration, a better understanding of the function of the JNK pathway in a model system should provide new insights into these syndromes.

Cell-specific neuron morphology dictates the functional connectivity between a neuron and its targets and hence determines the way the information is processed within the nervous system. In vivo, developing neurons extend axonal processes through a complex environment to find their appropriate targets. While much progress has been made in identifying guidance cues and their receptors, relatively little is known about the intracellular mechanisms by which axons convert these signals into directional decisions. Post-transcriptional regulatory mechanisms, however, have recently emerged as a critical component underlying the establishment of precise neuronal connectivity. In particular, active transport of mRNA to axons, coupled to local translation seems to largely contribute to the fast nucleus-independent response of axons to external cues, and thus to play a key role in axon growth and guidance. While local translation of few specific mRNAs has been demonstrated in response to guidance cues ex vivo, the biological relevance of this process still remains to be investigated in vivo. Furthermore, the precise molecular mechanisms controlling axonal mRNA transport and translation largely remain to be explored. Here, we propose to use Drosophila as a new model organism to i) functionally and dynamically study axonal mRNA targeting and translation in the context of a living organism, and ii) identify the trans-acting factors involved in this process and their target mRNAs. So far, our work has focused on the conserved RNA transport factor Imp/ZBP1. Using Drosophila adult Mushroom Body (MB) neurons as a model system, we have shown that this RNA binding protein is actively transported to growing MB ? axons, and that its function is required cell-autonomously for directed growth and branching of axonal processes. Combining biochemical and genetic assays, we have shown that Imp associates with and regulates the expression of an mRNA encoding a regulator of the actin cytoskeleton (F-actin polymerization factor). Our first main objective is now to dynamically image and analyze growing axons (both wild-type and imp mutant axons) on one hand, and protein-RNA complexes being transported within axons on the other hand. These experiments rely on a live-imaging protocol we have recently established, and will allow us i) to quantitatively describe the axon growth/guidance phenotypes associated with the disruption of axonal mRNA transport, and ii) to characterize the mode of transport of Imp-containing particles. The second main objective of this proposal is to study how Imp regulates the expression of its multiple mRNA targets, and what are the rules underlying the regulation of its post-transcriptional network in vivo. This part of the project relies on a genome-wide RIP-chip experiment we have already performed. Last, we will extend our study by performing a genetic screen to identify new conserved RNA binding proteins specifically involved in axon growth and guidance. With this screen, we hope to identify both partners of Imp and proteins with complementary functions.